Dicas da Bancada

Amplificação SSO

publicado em 14/03/2018 às 12:03

 

Com: Vinicius Florencio Echeverria
Graduado em biomedicina pela UNIFESP em 2004, trabalhou com análises clinicas de 2006 à 2011 e de 2011 à 2017, trabalhou nas áreas de biologia molecular e sorologia do Laboratório IGEN-AFIP. Há dois anos presta consultoria ao Laboratório de Histocompatibilidade da Santa Casa de São Paulo.

Carmen: Vinicius, quais são os itens que você considera mais críticos da etapa de amplificação na tipificação HLA por SSO?
Vinicius: Muitos itens são importantes, mas se eu fosse apontar os componentes mais críticos para a reação diria que são a Taq e as amostras de DNA. Isto porque os kits comerciais já estão muito desenvolvidos e basta você seguir o protocolo que eles funcionam bem.

Carmen: Bem, então vamos falar da Taq. Qual é a Taq mais indicada? 
Vinicius: A Taq mais indicada é a que apresenta o princípio “hot start”, existem várias Taqs comerciais com este princípio, elas reduzem o anelamento inespecífico dos primers aumentando a especificidade do produto amplificado.

Carmen: Quais são os cuidados que devemos ter ao usar a Taq?
Vinicius: A pipetagem da Taq é crítica por ser utilizada em volume muito pequeno. É aconselhável que o laboratório selecione uma ou duas pipetas bem calibradas exclusivas para a pipetagem da Taq. As ponteiras utilizadas devem ser bem ajustadas à pipeta.

Carmen: A viscosidade da Taq é um fator que exige cuidado, não?
Vinicius: A viscosidade da Taq exige muito cuidado pois a Taq adere facilmente à ponteira, no lado externo, alterando a precisão da pipetagem.

Carmen: O que você faz para evitar o excesso?
Vinicius: Devemos colocar a ponteira na superfície do líquido viscoso, sem aprofundar desnecessariamente. O ideal é depois de aspirar, retirar a pipeta raspando a ponteira na parede do tubo para retirar o excesso.

Carmen: O que acontece se for colocada Taq não for bem pipetada?
Vinicius: Imagine que você tem que colocar 2 microlitros de Taq, uma alteração de 0,5 microlitros já é um acréscimo de 25%. Isso interfere de forma determinante na intensidade da reação e na quantidade de produto amplificado no final. 

 



Carmen: Qual é o cuidado que você toma com armazenamento da Taq?
Vinícius: A Taq deve ser armazenada à -20 ºC e quando em uso, na bancada deve ficar à 0 ºC (em cooler ou gelo moído). Se a Taq ficar muito tempo fora destas condições vai haver diminuição da atividade e você vai observar que o produto amplificado é menor, a banda no gel de eletroforese pode ficar mais fraca e a intensidade do controle positivo no teste pode ser afetada.

Carmen: Bem, você falou que considera críticos a Taq e o DNA. O que é crítico no DNA?
Vinicius: A concentração e a pureza do DNA. O ideal é que o DNA seja quantificado e deve estar entre 20-50 ng/uL para a resolução intermediária, nos kits de alta definição o ideal é a concentração de 10 ng/uL.

Carmen: No SSO de alta definição a concentração é mais crítica, não?
Vinícius: Sim, na alta definição o resultado é facilmente comprometido se a concentração de DNA não estiver próxima de 10 ng/uL, especialmente nos kits de Classe I.

Carmen: E se o laboratório não tem como quantificar o DNA?
Vinicius: Isso vai impactar na alta definição, certamente. Para os Kits de média resolução é possível obter resultados bons mesmo com alguma variação na concentração do DNA. Muitos laboratórios vão acertando a diluição do DNA conforme veem o resultado das análises.

Carmen: O que acontece se você tem concentrações alteradas de DNA (para cima ou para baixo)?
Vinicius: Você deve suspeitar de que a concentração de DNA não está ajustada quando observar os controles positivos com valores sistematicamente muito diferentes do padrão do fabricante. A quantidade de Taq também vai influenciar nos valores de controle positivo.


 


Alterações no perfil do controle positivo


Carmen: E a contaminação do teste, ocorre nesta etapa?
Vinicius: Sim, a contaminação pode acontecer em vários pontos da amplificação: no material biológico, no reagente, nos equipamentos, etc. por isso a importância de seguir os protocolos e as boas praticas laboratoriais. No SSO, quando ocorre contaminação você tem mais beads positivas e o resultado, em geral, não fecha, além de positividade no controle negativo.

Carmen: Uma técnica bem feita, com reagentes cuidadosamente pipetados, equipamentos calibrados, Taq e DNA de boa qualidade garantem uma boa amplificação?
Vinicius: Não garantem totalmente, mas são o melhor caminho para ter bons resultados.